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9 décembre 2008 à 14h00, Bibliothèque de l’IBPC
Samir ELQAIDI, UPR 9073, Régulation de l'expression génétique chez les microorganismes
"Etude de la spécificité d'interaction des protéines homologues Mlc et NagC avec l'ADN chez E. coli"

Résumé

Les protéines NagC et Mlc sont des régulateurs transcriptionnels de l'expression des gènes d'utilisation des carbohydrates chez Escherichia coli. NagC est à la fois un répresseur et un activateur, elle réprime les opérons nag et chb et active les opérons glmUS et fim. Mlc est le répresseur des opérons manXYZ, ptsHIcrr, et des gènes ptsG, mlc et malT. Ces deux protéines présentent une forte homologie surtout au niveau de leur motif HTH. L'homologie concerne également leurs opérateurs respectifs. In vitro, chacune des deux protéines peut interagir avec l'opérateur spécifique de l'autre. Cependant, aucune régulation croisée n'a été détectée in vivo. L'analyse des sites spécifiques pour l'une ou l'autre protéine a montré que les bases CG aux positions ±11 du centre de symétrie de l'opérateur sont caractéristiques des sites de fixation de NagC et que la succession des bases CG dans la région centrale est différente entre les sites Mlc et les sites NagC. L'implication de ces critères dans la spécificité d’interaction de Mlc et de NagC avec l’ADN a été confirmée par des expériences de mutagenèse des opérateurs Mlc du gène ptsG. Ainsi la substitution des bases A/T à ±11 par des C/G et le remplacement du motif GCGC au centre des opérateurs ptsG par un motif CGCG, caractéristique des sites NagC, a permis de convertir la fusion ptsG-lacZ, normalement régulée par Mlc, en une fusion régulée par NagC. D'autre part, ces expériences ont confirmé que la répression par NagC nécessite sa fixation coopérative sur deux opérateurs, et que la fixation coopérative de Mlc sur deux opérateurs améliore la répression du gène ptsG.

Nous avons exploité ces données pour établir une séquence consensus dont l'utilité est de chercher d'éventuels gènes régulés par l'une ou l'autre protéine. La recherche informatique effectuée sur le génome d'E. coli a permis l'obtention d'une liste de candidats parmi lesquels le gène galP apparaît avec un très fort score. D'autre part, lors d'une étude de la souche MG1655, des travaux (Soupene et al, 2003) ont montré que cette souche pousse lentement dans le milieu galactose et que la vitesse de croissance augmente en présence de la mutation nagC. Par des expériences de protection à l’ADNase I ainsi que par la mesure de l'activité b-galactosidase d'une fusion galP-lacZ, nous avons montré que le gène galP est réprimé par NagC en coopération avec GalR et GalS, iso-répresseurs du régulon galactose. Donc la régulation de galP implique des régulateurs spécifiques de deux voies métaboliques différentes. Contrairement aux autres membres du régulon NagC, le gène galP est contrôlé à partir d’un site nagC unique. Deux sites de fixation de GalR dans la région régulatrice de galP ont été proposés par le laboratoire d’Adhya. Nous avons montré que le site dit "interne", n'est pas fonctionnel. Par contre, d'autres sites fixant GalR et/ou GalS ont été identifiés en amont du site "externe". Ensuite, en utilisant la technique de double hybride bactérien, ainsi que celle de l'anisotropie de fluorescence, nous avons montré que GalR interagit avec GalS aussi bien in vivo qu’in vitro. Nous proposons que galP soit contrôlé d’une façon différente de celle observée dans l’opéron galETK.


29 septembre à 14h30, bibliothèque de l'IBPC
Samuel TRAN, CNRS UPR 1929, Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire de la Sécrétion
"Etude de la sécrétion régulée par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente"

Résumé

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes : migration des granules de sécrétion (GS) vers la membrane plasmique (MP), accostage et arrimage des GS à la MP, exocytose ou fusion des GS avec la MP permettant la libération du contenu des GS dans le milieu extracellulaire.

Bien que très utiles, les méthodes électrophysiologiques et électrochimiques ne donnent d'informations ni sur la localisation ou les mouvements des GS avant fusion, ni sur le devenir de la membrane des GS après fusion. Plusieurs techniques d'imagerie in vivo cherchent à répondre à ces questions. La mieux adaptée est la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente (TIRFM) qui permet d'observer les mouvements de GS individuels à proximité immédiate de la MP. Nous avons appliqué cette approche à l'étude de la sécrétion des cellules BON (lignée dérivée d'un carcinome). Leur stimulation a été faite par la technique du Ca cagé, appliquée pour la première fois en microscopie TIRF.

Après exocytose, nous avons observé et quantifié le phénomène de persistance de la forme d'une partie des GS, ainsi que l'exocytose séquentielle de GS situés plus à distance de la MP. De manière surprenante, l'exocytose séquentielle représente ~25% des événements d'exocytose. L'analyse détaillée des trajectoires en 3 dimensions des GS avant leur fusion nous a montré qu'environ 40% des GS effectuent une transition de 20 nm vers la MP, puis fusionnent dans un délai de ~3 s. Cette observation originale de la transition entre l'accostage et l'arrimage des GS pourrait être la traduction d'évènements moléculaires impliqués dans l'amorçage des GS, nécessaire à la fusion.


30 juin 2008 à 14h30, amphithéâtre Constant Burg, Institut Curie, 12 rue Lhomond
Géraldine SERVANT, UPR 9073, Régulation de l'expression génétique chez les microorganismes
"Activation du rétrotransposon Ty1 de la levure Saccharomyces cerevisiae par la carence sévère en adénine"

Résumé

Entités génétiques capables de se déplacer dans les génomes eucaryotes, les rétrotransposons jouent un rôle majeur dans la structure, l'évolution et l'expression des génomes. Activés par des stress environnementaux, ces éléments sont associés à des maladies génétiques et à des cancers. Le rétrotransposon Ty1 de la levure S. cerevisiae est un modèle pour l'étude de la régulation et de l'impact des rétrotransposons. La transcription et la mobilité de Ty1 sont activées dans une souche privée d'adénine, déficiente dans la voie de biosynthèse de l'AMP, conditions nommées "carence sévère en adénine".
L'objectif de ma thèse a été de comprendre l'activation de l'expression de Ty1 par cette carence et d'étudier l'impact de cette activation sur le génome de la levure. Nous avons montré que la région longue terminale (LTR) de Ty1, où démarre la transcription, est suffisante pour permettre la régulation. Nous avons aussi découvert que la carence modifie la transcription de gènes adjacents au promoteur de Ty1. Cette étude montre l'impact des rétrotransposons sur la régulation des génomes, en particulier dans les conditions de stress, et suggèrent que la carence active le démarrage de la transcription. Par l'étude de l'expression des gènes et des concentrations en nucléotides puriques dans les conditions de carence sévère en adénine, nous avons montré une corrélation entre l'activation de la transcription de Ty1 et la diminution de l'ATP cellulaire. De plus, un mutant qui crée directement un déficit en ATP, induit l'activation de la transcription de Ty1 et mime les conditions de carence sévère en adénine. Le déficit en ATP pourrait donc être le signal de l'activation de Ty1


3 avril 2008 à 14h30, amphithéâtre Jean Perrin, Laboratoire de Chimie Physique
Brahim HEDDI, UPR 9080, Biochimie Théorique
"Propriétés structurales et dynamiques des ADN, implications dans les mécanismes de reconnaissance ADN/protéines"

Résumé

Dans cette thèse, nous avons exploré les propriétés structurales et dynamiques des ADN-B, en interfaçant techniques expérimentales et modélisation moléculaire. Nous avons d'abord mis en évidence par RMN en solution la mécanique intrinsèque des ADN-B, qui lie étroitement les conformations BI et BII des groupements phosphate (d31P) aux paramètres hélicoïdaux de roll (courbure), de twist (enroulement) et de déplacement des bases dans les sillons (dimensions des sillons). Ayant traduit pour la première fois les d31P en termes de ratio BI/BII, nous avons pu quantifier la relation entre la séquence, la structure et la flexibilité dans l'ADN-B, en établissant une échelle expérimentale qui associe une probabilité de conformation à chacun des dix pas dinucléotidiques constituant l'ADN-B. En utilisant les d31P comme une sonde, nous avons ensuite démontré sans ambiguïté que la nature des cations affecte la structure et la dynamique de la double hélice. Enfin nous avons évalué la capacité de trois champs de force (Parm98, Parmbsc0 et CHARMM27) à prédire la conformation des ADN-B. Ayant montré qu'aucun de ces champs de force n'était en mesure de rendre compte des données expérimentales, nous proposons un nouveau protocole de raffinement des structures RMN. L'application de ce protocole à la séquence cible de la protéine JunFos souligne l'importance d'avoir une vision globale de la dynamique de l'ADN pour comprendre les mécanismes de reconnaissance ADN/protéines.


2 avril 2008, à 14h00, amphithéâtre Jean-Perrin, Laboratoire de Chimie Physique
Marie-Pierre DURRIEU, UPR 9080, Biochimie Théorique
"Etude par modélisation moléculaire de la stabilité et de la dynamique du complexe SNARE impliqué dans la fusion membranaire"

Résumé

Le complexe SNARE est impliqué dans la fusion membranaire intracellulaire : sa formation entre des protéines liées aux vésicules (v-SNAREs) ou à la membrane cible (t-SNAREs) permettrait de surmonter la répulsion entre deux membranes. Des simulations atomiques par dynamique moléculaire ont été effectuées sur la tresse de quatre hélices qui constitue le coeur du domaine soluble du complexe SNARE neuronal. Ces simulations mettent en exergue l'extrême stabilité de la tresse. Une analyse structurale détaillée, prenant en compte la structuration en couches hydrophobes de la tresse, révèle un réseau dense de ponts salins et de liaisons hydrogène qui maintient le complexe. Nos résultats, en très bon accord avec des données structurales expérimentales, apportent également un éclairage nouveau. L'insertion de la v-SNARE dans la membrane vésiculaire a ensuite été étudiée par des simulations «gros-grain», dans le cadre du débat sur l'enfouissement de la région juxtamembranaire de la v-SNARE. Nos simulations indiquent trois topologies d'enfouissement, parmi lesquelles nous retrouvons les deux profils obtenus par Shin et coll. dans leurs expériences RPE.



25 février 2008, à 14h00, ENSCP, Salle 1 (11 rue Pierre et Marie Curie)
Agnès de LACROIX de LAVALETTE - UMR 7099, Physico-chimie moléculaire des membranes biologiques
"Etude des relations structure/fonction dans le complexe cytochrome b6f" -

 

 

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